La actual ciudad Guayaquil fue cambiando de nombre de acuerdo al lugar de su establecimiento, pero conservó el nombre de su santo patrono: Santiago.
La fecha oficial de fundación de Guayaquil
En 1929, el Concejo Municipal de la ciudad, encargó a varios historiadores de la época, una investigación que permitiera definir la fecha en la que debía festejarse la fundación de Guayaquil. La investigación estuvo a cargo de Modesto Chávez Franco, José Antonio Campos, Eleodoro Avilés, José Gabriel Pino Roca y Pedro José Huerta. La comisión determinó que, tras la consulta a fuentes y documentos, no se pudo determinar la fecha verdadera. Sin embargo, sugirieron al ayuntamiento de la ciudad que siguiera utilizando la fecha patronal de la ciudad; y además, que al no poder contar con un año preciso, se mantuviera el del asentamiento definitivo.
Desde la aprobación de esta disposición por parte del cabildo porteño, la fecha oficial adoptada es la del 25 de julio de 1535. Mientras que se considera como fundador definitivo a Francisco de Orellana. La ciudad se reconoció con el título de «Muy Noble y Muy Leal Ciudad de Santiago de Guayaquil».
La región en la que actualmente se encuentra ubicada Guayaquil fue habitada por varias tribus y culturas que dominaron estos territorios hasta la conquista española. Estos pueblos se desarrollaron a través de los períodos precerámico, formativo, y desarrollo regional. Para el período de integración, las últimas poblaciones precolombinas se extendieron aproximadamente desde el año 500 hasta el 1534.
En la parte occidental del río Guayas se situaban los huancavilcas o manteños del sur, sus dominios alcanzaban la península de Sumpe, actual provincia de Santa Elena y los territorios conformados en las provincias de Guayas y Manabí. En la parte oriental del río Guayas se encontraban los chonos, quienes tenían asentamientos en las actuales provincias del Guayas y de Los Ríos. En la zona cercana al golfo de Guayaquil y dispersa en varias localidades se encontraban los punáes y los jambelíes.
Las riquezas que ofrecían las tierras del nuevo mundo llegaron como noticias a España. A América del Sur a finales de 1531 llegaron por primera vez los españoles, recorrieron varios sectores de la costa ecuatoriana. Luego se introdujeron en la isla Puná donde se enfrentaron a los nativos en su camino hacia Tumbes.
A finales de agosto de 1535, Belalcázar entró al Golfo de Guayaquil, desembarcó temporalmente en la isla Puná y luego continuó su travesía remontando las aguas del río Guayas en busca de las vertientes andinas. Por noviembre, en virtud del acta de fundación de Santiago de Quito, cuyos documentos portaba, desembarcó cerca de un asiento indígena llamado «Guayaquile«, haciendo referencia a un cacique de la cultura Milagro Quevedo. En estos territorios Belalcázar concretó el traslado de Santiago a la región litoral. En este primer asentamiento quedaron cuarenta españoles en la pequeña población y Belalcázar decidió seguir su ascenso hasta Quito. Al poco tiempo de su partida, varias tribus de la cultura Milagro-Quevedo, los «chonos«, empezaron a atacar a la población, era 1536. Los españoles debieron abandonar la ciudad. En 1536, Zaera llega a Santiago y muda la ciudad al sitio denominado «Yagual» la asentó a inicios de agosto. El poblado empezó a adoptar el nombre de Santiago. En 1537, la ciudad de Santiago volvió a ser destruida por el reinicio de ataques de los nativos. Francisco Pizarro ordenó la reubicación y reconstrucción, la misión fue para Francisco de Orellana, quién llegó a Santiago para pacificarla y, una vez más, reubicarla, esta ocasión en las inmediaciones de sector conocido como «La Culata». A finales de 1538, Orellana terminó la reconstrucción y reasentamiento de la ciudad y luego partió al oriente ecuatoriano. La partida de Orellana dejó consecuencias poco favorables. El sucesor fue el Teniente Gobernador Diego de Urbina, quien ante las hostilidades de los aborígenes, en mayo de 1542, decide preparar un nuevo traslado de la ciudad hacia la zona occidental del actual río Daule, lo que actualmente es la parte norte de Guayaquil. Urbina trasladó la ciudad hasta ese sector, los territorios que pertenecían a los huancavilcas, a quienes se consideraban pacíficos, sin embargo, los huancavilcas destruyeron casi en su totalidad al poblado al cual llamaban Santiago de la Nueva Castilla. Urbina decidió un nuevo traslado que se dio el 20 de septiembre de 1543 en el mismo lugar donde Sebastián de Belalcázar, en 1535 la estableció por primera vez en la región. La ciudad fue asentada con el nombre de Santiago de Guayaquil, en memoria al pueblo indígena que vivía cerca del lugar. Santiago de Guayaquil, en aquella localía experimentó un período de paz.
Sin embargo, en el proceso de la colonización española general existían varias crisis y disputas políticas. Los hermanos Pizarro y los hermanos Almagro se enfrentaban en una guerra civil que concluyó el 26 de junio de 1541 cuando Francisco Pizarro cayó asesinado. Gonzalo Pizarro, su hermano, decidió alzarse en armas en contra de la corona, y en diciembre de 1544 ocupó militarmente Santiago de Guayaquil obligando al Cabildo de la ciudad a reconocerlo como Gobernador. En 1546 Miguel de Estacio es nombrado por Gonzalo Pizarro con el título de Teniente de Gobernador de la ciudad. A principios de 1547, Pedro de La Gasca fue enviado como pacificador para someter la rebelión de Gonzalo Pizarro. La Gasca deja a Rodrigo Vargas de Guzmán al mando de la ciudad como alcalde Ordinario. La población de Guayaquil consideraba la urgencia de un nuevo traslado. El lugar escogido sería la ribera opuesta del río Guayas, con la esperanza de tener mayor protección contra cualquier posible ataque. Sin embargo, el rápido crecimiento de Guayaquil en aquel tiempo hizo complicado el traslado. Finalmente, a mediados de 1547, Guayaquil se trasladó definitivamente a la ribera occidental del río Guayas en las faldas del Cerrito Verde, actual cerro Santa Ana. A partir de este asentamiento, la ciudad no volvió a trasladarse y emprendió un proceso de expansión urbana.